球孢白僵菌CDEP2基因原核表达、蛋白纯化及多克隆抗血清制备

类枯草杆菌蛋白酶是昆虫致病真菌重要的毒力因子,利用合成的特异性引物通过RT-PCR扩增了球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因.将其与质粒pET28a连接,构建重组原核表达载体pET28-CDEP2,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE检测His-CDEP2融合蛋白以包涵体方式大量表达并对其进行纯化.用SDS-PAGE分离纯化的CDEP2蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗血清.Western blotting免疫印迹检测分析表明,该抗血清对CDEP2蛋白有特异性识别能力,可用于对CDEP2蛋白功能的进一步研究.     

牛传染性鼻气管炎病毒gD基因截短表达及其抗血清制备

gD糖蛋白是IBRV感染细胞的主要分子,在病毒吸附和侵入宿主细胞中发挥着重要作用。利用IBRV基因组DNA为模板,经生物学软件DNAstar分析主要抗原区,PCR扩增gD基因786bp片段,定向连接到pET32a(+)表达载体中,筛选阳性克隆转化BL21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达部分可溶的重组蛋白。Ni-NTA非变性纯化系统纯化蛋白,纯化的蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,利用间接ELISA法检测抗血清效价为1∶6400;同时以该血清进行血清中和病毒实验,中和指数为1∶640,显示该抗血清具有良好的抗病毒能力,为进一步开发牛传染性鼻气管炎(IBR)的诊断检测试剂和疫苗奠定了重要基础。     

木薯细菌性枯萎病菌转座子库的构建及其质量评价

猫豆是广西种植的一种特色药用植物,近年来发生一些重要病害,为明确这些病害种类,对广西猫豆主产区进行主要病害种类调查和病原鉴定.每块地采取5点取样法进行取样调查,并通过形态特征和rDNAITS序列分析结果对病原菌进行鉴定.研究结果发现,猫豆上发生的主要病害有4种,分别为猫豆炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides)、猫豆茎溃疡病(Phomopsis sp.)、猫豆斑枯病(Alternaria sp.)和猫豆褐斑病(Pseudocercospora sp.),这些病害的发病率达30％ ～80％.     

水稻瘤矮病毒P12蛋白抗血清制备及其应用

为了进一步研究水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)P12的功能,将RGDV-GX P12编码区亚克隆至原核表达载体,并导入大肠杆菌诱导表达;重组的P12融合蛋白经Ni-NTA His·Bind Resins纯化后用于免疫小鼠制备抗血清,并进行Western blotting分析。结果显示,约41 kD大小的RGDV P12融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达;利用该重组蛋白所制备的抗血清可特异地与融合表达和非融合的P12蛋白发生强烈的免疫学反应。利用该特异性抗血清在病毒粒子样品中检测不到P12蛋白,而在病株总蛋白样品中可检测到1条与预期大小一致的明显条带,表明RGDV P12是一种非结构蛋白。     

Retrospective study of 103 presumed cases of tick (Ixodes holocyclus) envenomation in the horse

Objective Review 103 cases of presumed tick envenomation in horses. Design Retrospective study. Method Variables, including date of presentation, age, breed, weight, presence of ticks, gait and respiration scores, duration of recumbency, treatment, outcome and complications were recorded. A series of univariable screening tests were performed and used in a multivariable logistic regression model. Results There were a total of 103 cases affecting 10 breeds, aged between 1 week and 18 years of age. Horses >6 months old and weighing >100 kg had a higher odds of death than those <6 months old and <100 kg. Cases were seen from North Queensland to the central coast of New South Wales and were more likely to present in the warmer months. There was no association between the number of ticks found on an animal and death. Horses with a higher respiratory score had higher odds of dying, but there was no association between gait score and survival. Horses recumbent >120 h after presentation had higher odds of dying. Complications were reported in 35% of horses. The odds ratio for survival was higher for horses receiving >0.5 mL/kg of tick antiserum. Overall, 74% of horses survived. Multivariable modelling was limited by the small sample size. Conclusion In general, tick envenomation in horses follows the geographic distribution of Ixodes holocyclus. Tick antiserum administered at >0.5 mL/kg increases the odds of survival. It would appear that the complications associated with managing a recumbent horse increase the odds of death.     

鸡BLB重组蛋白的原核表达及多抗制备

为分析鸡主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类抗原β亚基BLB蛋白在鸡脾脏中的表达情况,本研究采用RT-PCR技术从鸡脾细胞中扩增了BLB基因的保守区第3外显子的部分序列,大小约为380 bp.将其克隆于表达载体pET-30a(+)中.在大肠杆菌BL21 (DE3)中,经IPTG诱导表达,获得大小约为19ku以包涵体形式存在的His-BLB重组蛋白.切取含有重组蛋白的SDS-PAGE胶免疫实验兔,获得抗血清.以制备的血清通过westemblot在鸡脾脏中检测到MHCⅡ类分子特异性条带,其大小约为28 ku,与BLB天然蛋白的大小相符合.本研究为进一步分析MHC-Ⅱ类分子在鸡体内的蛋白表达水平提供了依据.     

芜菁花叶病毒长春分离物p3基因的克隆、序列分析及P3蛋白抗血清的制备

 用RT-PCR方法从长春感染芜菁花叶病毒( Turnip mosaic virus,TuMV)的十字花科蔬菜中扩增获得该病毒的p3基因,并对其序列进行了比较分析。结果表明,本研究所获得的10个TuMV分离物p3基因含1 065个核苷酸,其序列一致率为98.8%~99.6%,与GenBank中其他15个TuMV分离物核苷酸一致率为80.9%~99.4%。根据p3基因核苷酸序列构建的系统进化树显示:25个TuMV分离物可分为4个组,本研究得到的10个TuMV分离物均属于basal-BR组。将TuMV JCR06分离物p3基因N端663 bp片段克隆至原核表达载体pET-28a(+),并在大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中表达出分子量约为28 kDa的融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔,制备了P3蛋白的特异性抗血清。以TuMV侵染的萝卜为抗原,间接ELISA测定抗血清的效价为1∶2 048。Western blotting分析表明,制备的抗血清能与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应。     

黄鳝(Monopterus albus)H-Y抗原的研究

利用自制的抗Ｈ－Ｙ血清,对黄鳝进行脾淋巴细胞毒性试验,检测各发育时期的性腺,脑,脾及肌肉组织,结果如下：（１）雄性有Ｈ－Ｙ抗原存在,雌性无;（２）性逆转过程中,Ｈ－Ｙ抗原从雌性到雄性是从无到有逐渐递增的;（３）黄鳝经１７α－甲基睾酮处理后,雌性,间性,雄性三个发育阶段Ｈ－Ｙ抗原的存在状况并未发现显著改变。     

猪转录因子Nanog高效表达、多克隆抗体制备及其应用

多能转录因子Nanog可维持干细胞的自我更新和多向分化潜能.为深入研究猪(Sus scrofa)Nanog在多能性调控网络的作用,本研究制备了鼠抗猪源Nanog多克隆抗体.首先,从猪肾脏中克隆Nanog基因CDS,再将CDS连接到pET32a质粒上,构建重组表达载体pET32a-Nanog.将重组载体转化大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3),经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,优化最佳诱导时间、温度和IPTG浓度等表达条件,获得分子量为57 kD的Nanog重组蛋白.将纯化的Nanog蛋白,免疫C57BL/6小鼠(Mus musculus),6周后获得阳性抗血清,通过Western blot和免疫荧光检测其抗体效价及其特异性.结果显示,在28℃、8 mmol/L IPTG、诱导2.5 h的条件下,可获得高效Nanog重组表达;制备的鼠抗猪Nanog多克隆抗体能特异性识别猪诱导多能干细胞表达的Nanog蛋白.研究结果为猪多能性干细胞的研究提供了有力工具.     

黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组全序列分析及病害的田间调查

为明确近年来在浙江省葫芦科作物上发生的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)基因组特征及其发生分布情况,从浙江省及上海地区的甜瓜、西瓜和瓠瓜上采集疑似样品进行RT-PCR鉴定,通过分段扩增测序的方法拼接获得基因组全序列并进行系统进化分析,利用特异性引物扩增获得CGMMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列,制备CGMMV CP抗血清进行Western-blot和Dot-ELISA检测。结果显示,来自甜瓜、西瓜和瓠瓜的3个CGMMV分离物基因组全序列均具有烟草花叶病毒属典型基因组结构特征,全部由6 423 nt构成;3个全序列间的核苷酸同源性高达99.11%~99.67%,编码的CP氨基酸同源性为100%。系统进化分析发现,CGMMV不同分离物形成2个进化相关群体,3个浙江的CGMMV分离物均位于第I组内,与已报道的中国CGMMV分离物和韩国CGMMV分离物亲缘性较高。Western-blot检测表明CGMMV CP抗血清可以与感病植株中的病毒发生特异性反应,可用于CGMMV鉴定;Dot-ELISA检测发现CGMMV在浙江省和上海市的葫芦科作物上普遍存在。